內(nèi)切酶是一類能夠識別并切割特定脫氧核苷酸序列的酶，不同類型的內(nèi)切酶在切割機制上存在差異。以下將詳細介紹不同類型內(nèi)切酶的切割機制差異。

一、限制性內(nèi)切酶

限制性內(nèi)切酶主要分為三種類型：Type Ⅰ、Type Ⅱ 及 Type Ⅲ。

Type Ⅰ 限制性內(nèi)切酶：既能催化宿主 DNA 的甲基化，又催化非甲基化的 DNA 的水解。其切割機制較為復(fù)雜，通常需要多個亞基協(xié)同作用，識別特定的 DNA 序列后，在遠離識別位點的地方進行切割。

Type Ⅱ 限制性內(nèi)切酶：只催化非甲基化的 DNA 的水解。Type Ⅱ 限制性內(nèi)切酶所識別的位置多為短的回文序列，所剪切的堿基序列通常即為所識別的序列。這類內(nèi)切酶在基因工程上實用性較高，如 EcoRⅠ、HindⅢ 等。其切割機制相對簡單，通常由單一的蛋白質(zhì)亞基組成，識別特定的 DNA 序列后，在識別位點處進行切割。

Type Ⅲ 限制性內(nèi)切酶：同時具有修飾及認知切割的作用。其切割機制與 Type Ⅰ 和 Type Ⅱ 有所不同，通常需要多個亞基協(xié)同作用，識別特定的 DNA 序列后，在識別位點下游一定距離處進行切割。

二、歸巢內(nèi)切核酸酶

LAGLIDADG 歸巢內(nèi)切核酸酶：是可用于基因組編輯應(yīng)用的位點特異性移動核酸內(nèi)切酶。其切割機制涉及對 DNA 形狀和柔韌性的間接讀出，特別是在發(fā)生切割的中心 4 個堿基處。通過功能選擇和深度測序分析發(fā)現(xiàn)，野生型活性位點并非對所有底物都是最佳的，新的活性位點殘基組合可以支持在野生型酶難以裂解的底物上的活性。例如，兩個金屬結(jié)合殘基中 E 或 D 取代的組合極大地影響了切割活性，而 E184D 變體具有更寬的切割特性。對 I-LtrI E184D 和與非同源 AACC 中樞 4 序列共結(jié)晶的野生型蛋白質(zhì)的分析顯示，結(jié)構(gòu)差異與切割單個 DNA 鏈的動力學(xué)常數(shù)相關(guān)。

其他歸巢內(nèi)切核酸酶：許多微生物的基因組中含有編碼罕見切割歸巢內(nèi)切核酸酶的遺傳元件，這些內(nèi)切酶有助于編碼它們的元件（如自剪接的 I 組和 II 組內(nèi)含子以及在某些情況下的內(nèi)含肽）的移動。歸巢內(nèi)切核酸酶有幾個不同的家族，它們啟動和靶向特定序列進行橫向轉(zhuǎn)移的能力使其成為有吸引力的基因靶向試劑。歸巢內(nèi)切核酸酶已被應(yīng)用于促進 DNA 修飾或基因組編輯，如基因修復(fù)或 “基因敲除"。對歸巢內(nèi)切核酸酶的工程改造策略也在不斷發(fā)展，以改變其靶位點特異性。

三、限制性核酸內(nèi)切酶 CglI

   來自谷氨酸棒狀桿菌的限制性核酸內(nèi)切酶 CglI 識別不對稱的 5'-GCCGC-3' 位點，并在依賴于 NTP 水解的反應(yīng)中切割頂部和底部 DNA 鏈下游的 DNA 7 和 6/7 核苷酸。CglI 由兩種不同的蛋白質(zhì)組成：核酸內(nèi)切酶（R.CglI）和 DEAD 家族的解旋酶樣 ATPase（H.CglI）。這些亞基與化學(xué)計量比為 R2H2 形成異四聚體復(fù)合物。然而，R2H2?CglI 復(fù)合物僅具有一個足以切割一條 DNA 鏈的核酸酶活性位點，這表明引入雙鏈斷裂需要兩個復(fù)合物。CglI 不需要在同一 DNA 上的兩個位點即可獲得最佳催化活性，但單點線性 DNA 的底物較差，支持了一種機制，其中 CglI 復(fù)合物必須在激活切割之前沿一維 DNA 輪廓連通。CglI 水解三磷酸腺苷（ATP）會優(yōu)先在 DNA 上從靶標的下游方向產(chǎn)生易位，盡管上游易位也是可能的。這種作用機制與其他 ATP 依賴性限制性修飾酶不同。

四、HigB 毒素切割核酸內(nèi)切酶

   HigB 毒素是一種與核糖體結(jié)合的核糖體依賴性毒素，其切割核酸內(nèi)切酶的機制如下：解決了綁定到核糖體的野生型，核糖體依賴性毒素 HigB 的 X 射線晶體結(jié)構(gòu)，揭示了 mRNA 底物附近的潛在催化殘基。使用基于細胞和生化分析，確定 HigB 殘基 His54，Asp90，Tyr91 和 His92 對于體內(nèi)活性較重要，而 HigB H54A 和 Y91A 變體對體外 mRNA 切割的影響大。比較具有 70S-HigB 結(jié)合結(jié)構(gòu)的兩個催化惰性 HigB 變體的 X 射線晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn) HigB 活性位點殘基可能經(jīng)歷構(gòu)象重排，可能需要識別其 mRNA 底物。

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