膜的選擇，印跡所使用的膜的類型可能影響下列因素：

NC膜和PVDF膜是Western blotting中常用的兩種膜。NC膜是世界上使用最為廣泛的特異性轉移介質之一，也是最早用于Western blotting的膜。PVDF膜在1985年被開發(fā)出來，在嚴苛條件下表現(xiàn)出更高的蛋白保留，比如有機溶劑存在時，或者在酸性或堿性條件下。

NC膜與蛋白質之間靠靜電和疏水作用結合，NC膜是親水膜，無需預先活化，對蛋白質的活性影響??；背景低；價格低廉，使用方便。缺點是韌性較差，易損壞，不能反復使用。在非離子型去污劑作用下，結合的蛋白容易被洗脫下來。

PVDF膜與蛋白質之間靠疏水作用結合，與NC膜相比，PVDF膜有著更高的機械強度和出色的化學穩(wěn)定性，適合多次剝離（stripping）和反復檢測（reprobing）。同時，PVDF膜有著更高的結合能力，NC膜的典型結合能力是80 -100 μg/cm2，而PVDF膜達到150-160 μg/cm2 （結合強度 PVDF膜比NC膜強 6 倍），這意味著靈敏度更高。由于PVDF膜的疏水性，成為疏水蛋白質（如膜蛋白）的機構疏松。也正因為如此，PVDF膜需要甲醇潤濕才能被常規(guī)的轉膜液所浸潤，繼而進行轉膜與蛋白結合。

綜上，現(xiàn)階段實驗室印跡轉印膜常用PVDF膜而非NC膜。

在分子水平，蛋白質吸附至少部分源于疏水氨基酸側鏈與聚合物表面疏水區(qū)的相互作用。Matsudaira（1987）觀察到，在疏水殘基被切割之后，小肽的測序效率下降80%，這可能是由于殘余肽段被洗脫。同時，在肽段消化降解時，也觀察到疏水肽段往往不能像親水肽段那樣高效洗脫（Iwamatsu，1991；Fernandez等，1992）。McKeon和Lyman（1991）發(fā)現(xiàn)，轉印緩沖液中添加的Ca2+離子可增強鈣調蛋白與Immobilon®-P轉印膜的結合。鈣的結合導致蛋白質分子結構中形成一個疏水袋，從而增加蛋白與膜的結合。

綜上，PVDF膜結合蛋白的機理：PVDF膜的表面具有疏水性，而許多蛋白質也具有疏水性區(qū)域，PVDF膜表面和蛋白質疏水區(qū)域之間發(fā)生疏水作用導致其相互結合。

PVDF膜為什么需預先活化：

PVDF膜本質是一種疏水性的聚合物，具有疏水性且不帶電荷，不能被轉膜液所浸潤，為了在水性緩沖液中使用，需要在使用前進行預處理以浸潤和活化膜。最常見的方法是使用50%（v/v）或更高濃度的醇（甲醇、乙醇和異丙醇）溶液浸潤和活化，使PVDF膜中微孔內的空氣被低表面張力的甲醇所替代，從而易于后續(xù)水或者緩沖液進入PVDF膜中的微孔內，使PVDF膜從疏水性變成親水性，隨著膜的外觀從不透明變?yōu)榘胪该?，表明PVDF膜已經浸濕。之后用水反復沖洗以去除醇類，再將膜直接放入轉印緩沖液中平衡。一旦膜被浸濕，通過電轉移，蛋白質與膜接觸產生疏水作用而被吸附在PVDF膜上。

在電轉移過程中，蛋白與膜的結合貫穿整個膜的厚度(深度)，結合能力是由孔的內部表面積來決定的（Mansfield，1994）。隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量的蛋白結合就越牢固，但是膜孔徑如果小于0.1 μm，蛋白的轉移就很難進行了，原因是蛋白質分子的直徑大約在1-100納米之間。

PVDF膜孔徑越小對低分子蛋白吸附越牢固的機理：較小的孔徑會限制蛋白分子的運動，使其轉移速度變慢，蛋白與膜的結合更充分，更容易被攔截在孔道內。此外，較小的孔徑也可以提供更高的膜表面積，從而提高了蛋白與膜接觸的機會。同時，較小的孔徑也可以提供更高的表面密度，從而增加了孔道與溶液之間的分子間吸引力，這種吸附方式稱為“毛細作用"。Schweitzer和Kriz在一項研究中發(fā)現(xiàn)，較小的孔徑可以提供更高的蛋白密度并增強其吸附能力。另一方面，蛋白分子量越低，蛋白的比表面積越大，與膜接觸面越大越充分，結合更緊密。

通常情況下，大于20 kD的蛋白選擇0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白選擇0.2 μm的膜。0.2 μm PVDF膜內部表面積大約是0.45 μm PVDF 膜的三倍，使其吸附能力更高?？傊x擇PVDF膜的孔徑大小需要根據樣品蛋白的大小和特性來確定，以獲得較好的結合效果。