大腸桿菌（E.coli）表達重組蛋白的技術經過多年的發(fā)展，已經成為一個非常成熟表達系統(tǒng)。為了在大腸桿菌表達體系中獲得可溶以高表達產量的蛋白，一個優(yōu)秀的表達策略是重要的。
為了高效表達有活性蛋白，一般需考慮以下幾個因素：
1.宿主體系的選擇
細菌、酵母、哺乳動物細胞、絲狀真菌和單細胞藻類均可以作為表達宿主，每一種表達宿主都有各自的優(yōu)缺點。如果需要表達的蛋白具有真核的翻譯后修飾（糖基化修飾），那么可以選擇酵母、哺乳動物細胞等，而大腸桿菌等原核表達體系則不適用。
大腸桿菌作為表達外源蛋白廣泛體系，其優(yōu)點主要包括：（1）菌體繁殖速度快，20分鐘即繁殖一代，如果按照1/100的比例進行接種（MOI），只需要對其培養(yǎng)幾個小時即可到達穩(wěn)定期；（2）容易實現高密度培養(yǎng)，理論培養(yǎng)密度是1×10^13 cells/ml，實際培養(yǎng)過程中如果使用的是LB培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)密度一般比1×10^10 cells/ml略小。而在低溫（<11℃）誘導蛋白表達時，細菌個數幾乎不增長。（3）比較容易轉染外源DNA，質粒轉染效率非常高。
2.質粒的選擇
一般來說，重組蛋白表達質粒載體融合了復制子(Replicon)、啟動子(promoter)、親和標簽(affinity tags)、篩選標記(selection marker)、多克隆位點（MCS）和融合蛋白去除策略(fusion tag removal strategy)，如下圖所示：
 
復制子：包含復制起始點及相關順式作用控制元件（cis-acting control elements）。在選擇質粒載體時，質?？截悢凳且粋€非常重要參數，應重點考慮。目前可從市場上購買到的載體非常多，如pET、pUC、pACYC 、pBAD和pSC101等。pET系列載體含有pMB1起始子，在單個菌體中該類質粒的拷貝數通常為15-60；pUC系列含有一個突變的pMB1起始子，在該系列的載體在單個細菌中的拷貝數通常為500–700；pACYC和pBAD系列常被用于雙表達體系，如FRET系統(tǒng)，該系列含有p15A起始子，單個細胞中質粒的拷貝數為10-12；pSC101系列載體在單個細胞中的拷貝數較少，通常<5個，此類載體常被用于三種蛋白的共表達。
啟動子：在重組蛋白大腸桿菌表達體系中，有多種啟動子，入Lac、tac、T7、pL、cspA啟動子等。lac啟動子是最為常用的啟動子之一，當培養(yǎng)基中只有乳糖（lactose）作為碳源時，lac啟動子被激活，開始表達重組蛋白。T7啟動子作為另外一種經常使用的啟動子，當含有T7啟動系統(tǒng)的質粒轉染進入細菌后，培養(yǎng)至一定濃度后，加入IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，一種非水解性的乳糖類似物）即可誘導大腸桿菌表達重組蛋白。
抗性篩選標簽：質粒載體通常采用的抗性基因包括氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素，慶大霉素和四環(huán)素等抗性基因，在重組蛋白表達與純化過程中，大部分加入的外源抗生素自然降解(如氨芐青霉素37℃條件下半衰期為16小時)或被去除掉，只剩下微量殘留（一般<1pg/ml純化蛋白），我們開發(fā)了相應的ELISA試劑盒能夠快速檢測抗生素殘留量（檢測靈敏度0.1pg/ml）。
融合標簽：為了使蛋白的下游純化過程更加容易以及促進某些不溶性蛋白可溶表達，通常在表達目標蛋白的N端或C端會加入融合標簽。融合標簽可分兩類：一類是短肽類標簽；一類是長肽類標簽，主要以融合蛋白（fused partner）形式共表達。短肽標簽主要作用是使蛋白下游純化更加快捷高效，長肽類標簽更多的作用是促進蛋白可溶性表達；短肽類標簽一般只含幾個氨基酸，分子量一般小于2 kDa，對重組蛋白的性質影響較小。親和標簽可以放置在蛋白的C-端或N-端，如需要表達分泌性蛋白，一般放置于C-端，信號肽通常放置于N-端。不同的蛋白標簽需要根據具體案例來分析，常用的蛋白標簽性質，如下表所示
 
標簽去除的酶切位點：對于一般性的生物學研究，蛋白標簽可以不用去除，如pull down實驗和CO-IP實驗，通常需要保留標簽(如GST、His標簽等)以便將目的蛋白從混合物中直接分離出來。當涉及到蛋白結構研究時，則需要去除目標蛋白的融合標簽或融合伴侶。去除蛋白標簽的方法可分為兩類，一類是酶消化法；一類是化學裂解法?；瘜W裂解法通產被用于融合伴侶蛋白的去除，如CNBr用于裂解與Met氨基酸C-端連接的多肽，該方法優(yōu)點是價格便宜，缺點是蛋白序列中不能存在其他的Met殘基。另一種最為常用的蛋白標簽去除方法為酶消化法，如腸激脢（Enterokinase），凝血酶（thrombin），factor Xa和煙草蝕紋病毒蛋白酶 (TEV protease)等移除蛋白標簽，使用酶法進行標簽的切除通常會殘留少數幾個氨基酸殘基。其中帶有His標簽的TEV作為一個被廣泛用于蛋白標簽去除實驗的標簽，其具有一個非常優(yōu)秀的特點:在切除標簽后，只殘留一個Ser或Gly殘基或不殘留氨基酸殘基。
3.蛋白表達宿主的選擇
在使用大腸桿菌表達重組蛋白時，常采用BL21（DE3）和K-12衍生菌株作為表達宿主。Studier 于1986年提出BL21菌株，隨后不同基因工程修飾菌株相繼誕生。BL21菌株缺乏Lon蛋白酶和外膜蛋白酶OmpT。Lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白，外膜蛋白酶OmpT主要功能是降解胞外基質蛋白。同時BL21菌株具有先天性的hsdSB基因突變，菌株失去甲基化和降解外源轉染質粒的能力，使得質粒能夠傳代保留至子代細菌中（hsdSB突變基因來源于父輩B834菌株）。另一種時K-12系列菌株，該系列菌株具有兩大優(yōu)點：一個是能夠促進胞質中蛋白二硫鍵的形成(主要原因是trxB（thioredoxin reductase）基因發(fā)生突變)；另一個是外源質粒能夠在宿主菌種中穩(wěn)定存在(主要原因時recA基因發(fā)生了突變)。
常見的重組蛋白表達技術問題匯總
重組蛋白表達永遠不是一蹴而就的事情，任何一種方案不會適用于所有案例，蛋白表達可以說是一個不斷嘗試的過程，下表總結了一些常見的蛋白表達技術問題及其應對策略。
 
更多蛋白組學實驗設備、實驗室試劑、生物耗材采購等進入蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司了解。