內(nèi)毒素(Endotoxin)是一種脂多糖(LPS)，來源于革蘭氏陰性細菌外膜，其細胞壁外膜的外部脂質(zhì)成分由內(nèi)毒素分子組成，細胞死亡或分解后被釋放出來。LPS具有三個結構，由菌體特異性多糖、非特異性核心多糖和脂質(zhì)A三部分構成。內(nèi)毒素單體分子量為10kDa左右，在不同成分水溶液中，可形成大分子聚集體，大的可超過1000 kDa。類脂A是內(nèi)毒素多種生物活性或毒性反應的主要基團。該基團沒有種屬特異性, 所以各屬細菌的類脂A 結構相似, 其毒性反應相似，如發(fā)熱、血液流動力學改變、彌漫性血管內(nèi)凝血, 并導致休克等。O-特異多糖位于菌體胞壁的最外層，由若干重復的寡糖單位組成。多糖的種類與含量決定著細菌種、型的特異性，以及不同細菌間具有的共同抗原性。它還參與細菌的抗補體溶解作用。

內(nèi)毒素不是蛋白質(zhì), 熱穩(wěn)定性強。在 100℃的高溫下加熱1h 也不會被破壞, 115℃30m in 濕熱僅能破壞 25% 左右的熱原質(zhì)。只有 180℃ 3～ 4h 或 250℃ 1～ 2h 干烤, 或用強堿、強酸或強氧化劑加溫煮沸 30min才能破壞它的生物活性。

內(nèi)毒素帶有負電荷, 由于脂多糖結構中類脂 A 的疏水性, 使得內(nèi)毒素傾向于以高分子聚合物的狀態(tài)存在而難溶于水, 并由于環(huán)境中 Ca2+、Mg2+等被吸引到帶負電荷的脂多糖上而得以穩(wěn)定。通常其分子量幾十萬至上千萬道爾頓。

內(nèi)毒素的產(chǎn)生：

基因工程蛋白通常采用細菌、酵母、哺乳動物細胞或昆蟲細胞作為宿主進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn), 但大多是以大腸菌作為表達系統(tǒng)。以大腸桿菌作為表達系統(tǒng)的蛋白通常都是在胞內(nèi)表達, 在純化蛋白之前必須通過高壓勻漿、超聲波破碎或低壓滲透等方法將菌種破壁, 以釋放蛋白。同時細胞壁內(nèi)的脂多糖也大量釋放到緩沖液中, 通常 10% 的濕菌濃度可產(chǎn)生幾萬EU/mL 的內(nèi)毒素, 這是內(nèi)毒素的主要來源。

對于酵母表達系統(tǒng)或 CHO (中國倉鼠卵巢細胞系) 系統(tǒng)等, 雖然表達系統(tǒng)本身不產(chǎn)生內(nèi)毒素, 但在生產(chǎn)過程中因原輔材料, 生產(chǎn)環(huán)境以及個人操作等因素造成產(chǎn)品內(nèi)毒素污染, 這是產(chǎn)生內(nèi)毒素的另一來源。

在生產(chǎn)過程中如何防止內(nèi)毒素污染：

①粗純中防止內(nèi)毒素污染 無論是酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞表達系統(tǒng)還是大腸桿菌表達系統(tǒng), 在生產(chǎn)過程中以各種途徑利用各種方法有效地防止內(nèi)毒素污染均是非常重要的。前者本身不產(chǎn)生內(nèi)毒素, 只要在生產(chǎn)過程中能有效防止內(nèi)毒素的污染, 就可以得到熱原合格的產(chǎn)品; 后者雖然不可避免地產(chǎn)生內(nèi)毒素, 但通常在初步純化中已采取有效措施, 可以大量減少內(nèi)毒素含量。

②通過無菌操作和控制操作區(qū)潔凈度來防止外源性內(nèi)毒素污染。首先, 生產(chǎn)車間必須是符合 GMP要求的潔凈廠房, 各種不同的操作在不同的潔凈區(qū)內(nèi)進行, 例如發(fā)酵和粗純應該在十萬級區(qū)進行, 精純在萬級區(qū)域內(nèi)進行, 制劑、分裝須在百級間或?qū)恿髡窒逻M行操作。對于任何非封閉系統(tǒng)的操作, 均應采取無菌操作方式, 如果系統(tǒng)自動化程度較高, 可遙控操作或較少手工操作。

③對于任何直接接觸制品的溶液、容器、生產(chǎn)用具、管路、生產(chǎn)系統(tǒng)等必須進行嚴格有效的處理, 去除熱原。用蒸餾法或反滲法制備的新鮮注射用水或滅菌注射用水通常都是無熱原的, 這是清洗器具及配制溶液的基礎。生產(chǎn)器具一類是玻璃器皿, 不銹鋼制品, 這些器具可置180℃ 3～ 4h 或 250℃ 1～ 2h干烤, 除去熱原。另一類為橡膠、塑料制品, 如膠塞、膠管等, 可采用 0.1M鹽酸煮沸30min, 或 0.1M氫氧化鈉浸泡 4h以上, 急用時可煮沸30min, 然后用新鮮注射用水沖洗凈, 再高壓滅菌。對于生物制藥的某些關鍵步驟可采用無菌、無熱原的一次性器具, 既可以減輕勞動量, 又可以防止清洗不凈帶來的污染。溶液配制要使用無熱原的新鮮注射用水, 整個過程必須于 3h 內(nèi)完成, 并及時高壓滅菌。對于一些不能滅菌的溶液, 可通過超濾法除熱原。如(PBS) 在高壓滅菌時會產(chǎn)生具有紫外吸收的焦磷酸, 在使用磷酸鹽液緩液(PBS) 進行柱層析時, 就對層析圖譜產(chǎn)生干擾, 在干擾素的生產(chǎn)與檢定中曾經(jīng)出現(xiàn)過這樣的問題, 采用截留相對分子質(zhì)量 (NMWL ) 為 10kDa的超濾膜超濾可有效去除溶液中的熱原。

生物技術藥品的生產(chǎn)中, 對于系統(tǒng)、管路的清洗涉及在位清洗(CIP)/在位滅菌(SIP)的概念主要是針對泵、管道、閥門、濾器、柱、各種罐等需定期清洗滅菌的設備,常規(guī)要求在不拆任何組件的情況下原位進行。例如層析系統(tǒng),它是生物技術藥品生產(chǎn)中廣泛使用的單元操作,在清洗/在位滅菌十分重要,有效的在位清可以減少產(chǎn)品污染的危險性、維持柱效和提高介質(zhì)壽命。氫氧化鈉被經(jīng)常用作在位清洗時的清洗液。

細菌內(nèi)毒素的檢測：

細菌內(nèi)毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素, 以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的含量是否符合規(guī)定的一種方法。鱟試劑法的反應機理是細菌內(nèi)毒素在二價陽離子參與下激活鱟血細胞溶解物中的一系列凝聚酶的反應。其包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì) 法。檢測時可用其中任一種方法，當結果有爭議時，另有規(guī)定外，以凝膠法結果為準。鱟試劑法具有簡便、迅速、定量準確、靈敏度高等優(yōu)點，在國際上受到廣泛應用，已被美國、歐洲、日本等國《藥典》及《生 物制品規(guī)程》收載，我國2005年版藥典也已收載，應用于藥品、生物制品的熱原檢定。

細菌內(nèi)毒素的去除：

由于內(nèi)毒素顯著的危害性，F(xiàn)DA等法規(guī)也對內(nèi)毒素的控制和將其降低到安全水平提出明確要求。無菌操作和操作區(qū)潔凈度也是控制外源性內(nèi)毒素污染的有效手段。然而對于樣品本身就存在的內(nèi)源性內(nèi)毒素污染，即使外源性內(nèi)毒素得到有效控制，最終工藝制備的樣品也存在內(nèi)毒素超標的風險。那么就需要從樣品本身制備工藝角度，結合內(nèi)毒素特點，尋找有效方法，使樣品本身內(nèi)毒素(Endotoxin)降低，達到工藝要求，提高產(chǎn)品安全性。
①疏水層洗法：一般來說內(nèi)毒素的疏水性都是遠遠大于目標物的，因此在疏水層析上樣需要高鹽緩沖液平衡，內(nèi)毒素在高鹽下發(fā)生凝集，不結合疏水介質(zhì)，因而上樣時直接穿透而被去除。或者采取目標樣品流穿模式，在一定鹽濃度下使目的蛋白不結合填料，而內(nèi)毒素分子可與填料結合，使兩者實現(xiàn)分離。

②離子交換法：對于陰離子交換層析，內(nèi)毒素在 pH>2時帶負電荷，與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAE有較強結合, 可使用目標蛋白從陰離子交換填料流穿的方式去除內(nèi)毒素；也可在目標蛋白和內(nèi)毒素同時結合于層析介質(zhì)上后，由于內(nèi)毒素的結合能力較蛋白的結合能力強，因此可先將目標蛋白洗脫出來，然后再用高鹽緩沖液或NaOH將內(nèi)毒素洗出。對于陽離子交換層析，在pH4.0時，內(nèi)毒素還是帶有負電荷不能和填料結合而隨流動相流出層析柱，目標蛋白則可以與陽離子交換介質(zhì)結合，因此采用陽離子交換層析也可以很好的去除內(nèi)毒素。此外，采用一些表面活性劑比如Triton X-114，既能阻止內(nèi)毒素結合在陰離子柱上也可阻止內(nèi)毒素結合在陽離子柱上。

③凝膠過濾層析：內(nèi)毒素可在水溶液中以非極性和離子相互作用，形成大小為 1,000 kDa 分子聚集體，它與多數(shù)生物蛋白分子量差異較大，基于這一特征，可以采用凝膠過濾層析，將大分子內(nèi)毒素分子與目標蛋白分離。但其處理量小, 處理時間較長。

④TFF切向流技術去除內(nèi)毒素：內(nèi)毒素在不同的水溶液中，常形成聚集體結構，因其聚集的程度不同，分子大小不一。小聚集體分子量為10~20 kDa，而大聚集體的分子量可達1000 kDa。使用切向流膜孔徑小于內(nèi)毒素的分子量而使內(nèi)毒素分子截留，目標樣品透過膜孔，達到去除樣品中內(nèi)毒素的目的。影響蛋白溶液中內(nèi)毒素去除因素主要包括，目標分子的大小分布、內(nèi)毒素與目標分子的相互作用、目標蛋白質(zhì)濃度以及是否添加相應的洗滌劑。

⑤通過親合層析去除內(nèi)毒素:  親合層析技術, 特別是免疫吸附劑在生產(chǎn)中的運用使得生物大分子的純化變得簡單。免疫吸附的原理基于抗原、抗體的特異性作用, 以目標蛋白作為抗原, 將通過雜交瘤技術生產(chǎn)的單克隆抗體偶聯(lián)于介質(zhì)上, 以此介質(zhì)來吸附目標蛋白。由于相互作用的高度特異性, 理論上僅有目標蛋白吸附于介質(zhì)上, 內(nèi)毒素全部穿透, 洗脫后將得到純度很高的無熱原產(chǎn)品。實際上, 由于介質(zhì)本身存在的非特異性吸附, 仍有少量的雜蛋白和內(nèi)毒素同時被吸附, 但內(nèi)毒素含量是極低的。在干擾素(IFN)生產(chǎn)中, 洗脫物內(nèi)毒素含量一般為0.25EU/mL。

⑥利用特異性吸附內(nèi)毒素介質(zhì)去除內(nèi)毒素：將內(nèi)毒素底物LAL或多粘菌素B(PMB)偶聯(lián)于層析介質(zhì)上, 以此介質(zhì)特異性吸附內(nèi)毒素, 而蛋白不會被該層析介質(zhì)吸附隨流動相流出，收集該流出蛋白即可。該方法去除內(nèi)毒素效果較好, 但有一定的蛋白損失。

總的來說，目前還沒有適用于生物制藥工藝中去除內(nèi)毒素的通用方案。尤其內(nèi)毒素含量特別高的樣品，單一方式去除效果不好時，需要結合不同生物制品和不同工藝的特點，考慮多種方式組合以降低工藝過程的內(nèi)毒素雜質(zhì)，提高產(chǎn)品安全性，從而滿足相關法規(guī)要求。

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