標簽：單克隆抗體技術(shù) 生物反應(yīng)器 

抗體是具有免疫活性的糖蛋白結(jié)構(gòu)。當它們識別細菌、病毒或腫瘤細胞等異物時，它們能夠識別或誘導(dǎo)中和免疫反應(yīng)。免疫球蛋白由 B 淋巴細胞響應(yīng)抗原的存在而產(chǎn)生和分泌。目前，單克隆抗體技術(shù)(mAb) 主要是從這些細胞的培養(yǎng)中產(chǎn)生的。其需求的培養(yǎng)條件如下：

培養(yǎng)基的要求

哺乳動物細胞的培養(yǎng)基必須含有復(fù)雜的成分，從氨基酸到微量元素。為了滿足細胞對這些營養(yǎng)素的需求，培養(yǎng)基在其成分中使用血清，然而，由于缺陷朊病毒引起的疾病的出現(xiàn)，例如牛海綿狀腦炎 (BSE)，因此有很大的動機去除任何動物成分培養(yǎng)基成分，特別是如果培養(yǎng)基用于生物制藥產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)。這導(dǎo)致了不含任何動物成分的培養(yǎng)基的出現(xiàn)，包括用于 CHO 和 NS0 的明確培養(yǎng)基，這是 mAb 生產(chǎn)中常用的兩種細胞類型。由于開發(fā)合適的培養(yǎng)基成本較高好。所以，許多公司喜歡開發(fā)自己的生產(chǎn)培養(yǎng)基來維持生產(chǎn)批次之間的成分，并為將要使用的特定細胞類型開發(fā)合適的培養(yǎng)基成分，并實現(xiàn)對生產(chǎn)的更大控制。除此之外，開發(fā)滿足高純度產(chǎn)品要求的下游工藝和驗證最終產(chǎn)品質(zhì)量的測試會提高基于單克隆抗體的藥物的總體生產(chǎn)成本。盡管開發(fā)培養(yǎng)基很復(fù)雜，但在這一領(lǐng)域已經(jīng)取得了很大進展，允許在合適的條件下進行更大的細胞生長并增加細胞保存時間，以促進目標分子的生長和生產(chǎn) 。

培養(yǎng)條件的要求

細胞生長條件可以直接影響感興趣分子的細胞生長和生產(chǎn)水平。通常，用于 mAb 生產(chǎn)的哺乳動物細胞培養(yǎng)條件非常明確：37 °C、pH 7.15 和30–60% 的溶解 O 2 (OD) 水平。二氧化碳2監(jiān)測水平以模擬 31 至 54 mmHg 之間的生理標準。然而，細胞條件的變化已顯示出改變細胞代謝向細胞生長或分子產(chǎn)生的巨大潛力，這可用于增加 mAb 的產(chǎn)生。生物過程可以設(shè)計為分兩個階段進行。首先，優(yōu)化細胞生長以達到一定的細胞密度。一旦達到這個密度，第二階段就開始了，生物反應(yīng)器的條件發(fā)生了變化，因此細胞繼續(xù)以維持速率生長，并將新陳代謝引導(dǎo)向單克隆抗體的產(chǎn)生。一些 CHO 細胞株和雜交瘤細胞對溫度和 pH 值的變化很敏感。當溫度和 pH 值低于通常使用的值時，值分別在 30 到 35°C 和 6.7-7.0 之間，細胞生長代謝減少，比產(chǎn)量增加。生長代謝減少還有助于降低某些對細胞培養(yǎng)物有毒的代謝化合物的產(chǎn)生，從而提高細胞活力，從而花費更多時間產(chǎn)生感興趣的分子。監(jiān)測細胞培養(yǎng)生長階段以控制培養(yǎng)變化的一個好方法是觀察 DO 和 pCO2 個水平，也可以對其進行調(diào)整，以最大限度地提高 mAb 等蛋白質(zhì)的產(chǎn)量 。

單克隆抗體生產(chǎn)工藝

用于 mAb 生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)可以遵循三種不同類型的過程。其中較簡單的是批量生產(chǎn)，它由一個封閉系統(tǒng)組成，在該系統(tǒng)中，生物反應(yīng)器被滅菌并用含有細胞生長和產(chǎn)品制造所需的所有營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基制備，然后接種細胞。沒有新鮮培養(yǎng)基的進料系統(tǒng)或用過的培養(yǎng)基的退出。隨著過程的進行，營養(yǎng)濃度降低并產(chǎn)生廢物代謝物，從而降低細胞活力。

在此過程之中過程由于反應(yīng)器內(nèi)的環(huán)境很快變得不利于細胞生長，同時廢物濃度增加。初始營養(yǎng)濃度和代謝廢物產(chǎn)生等培養(yǎng)因素直接決定了細胞在浴培養(yǎng)中可以達到的MAX濃度。通常，這種培養(yǎng)方式的MAX密度為 1-2 × 106細胞/mL，然后細胞活力迅速下降。生產(chǎn)過程持續(xù) 4-7 天，當生產(chǎn)力達到一定的關(guān)注濃度時。收集上清液并通過下游工藝回收產(chǎn)品。每批完成所需的時間還取決于生產(chǎn)動力學。如果生產(chǎn)依賴于生長（生產(chǎn)與細胞生長同時發(fā)生），則可以在細胞達到穩(wěn)定期后立即停止批處理。

與分批相比，使用的第二種生產(chǎn)過程是連續(xù)發(fā)酵。有兩種類型的連續(xù)生產(chǎn)：恒化器培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)。關(guān)于恒化器培養(yǎng)，將新鮮培養(yǎng)基添加到生物反應(yīng)器中，并以恒定流速將發(fā)酵培養(yǎng)基與細胞一起去除，以使培養(yǎng)體積保持不變。流速（稀釋率）控制細胞生長，當這兩個變量相等時，生物反應(yīng)器達到平衡——細胞濃度、營養(yǎng)濃度和產(chǎn)品濃度保持恒定。在這種情況下，培養(yǎng)物可以保持平衡數(shù)月，達到 10-30 × 10 6 個細胞/mL  。

為了避免活細胞損失以及細胞代謝副產(chǎn)物的不斷流出，許多制造廠開發(fā)了細胞回收系統(tǒng)，因此開發(fā)了灌注培養(yǎng)方法，將細胞保存在生物反應(yīng)器內(nèi)。連續(xù)發(fā)酵的缺點是會使用大量昂貴的培養(yǎng)基和難以回收的產(chǎn)品，產(chǎn)品過度稀釋。為了解決產(chǎn)品稀釋問題，一些生產(chǎn)制造廠有超濾系統(tǒng)，將產(chǎn)品保留在生物反應(yīng)器內(nèi) 。此類過程的另一個障礙是，為穩(wěn)定的工業(yè)生產(chǎn)工廠建立培養(yǎng)條件可能需要數(shù)月時間。為此，所使用的菌株必須非常穩(wěn)定，并清楚地闡明其生理方面，例如生長速率、生產(chǎn)力和對某些壓力條件的反應(yīng)。在穩(wěn)定的生產(chǎn)工廠落戶之前，多次嘗試的情況并不鮮見，但是一旦落戶，這種生產(chǎn)過程可以帶來許多優(yōu)勢，因為它可以在更小體積的生物反應(yīng)器中運行，因此具有更大的生產(chǎn)靈活性。

第三種生產(chǎn)單克隆抗體的工藝是迄今為止工業(yè)規(guī)模使用較多的工藝，即分批補料工藝。在這個過程中，細胞密度達到 8-12 × 10 6 個細胞/mL，并且通過在一定的時間間隔內(nèi)控制營養(yǎng)添加來提高生物反應(yīng)器中的細胞活力。生產(chǎn)過程可能需要 12-20 天。通常，初始培養(yǎng)中使用的相同培養(yǎng)基也用于飼喂，但濃度更高?？梢栽O(shè)計補料溶液組合物，通過分析和識別消耗更多的培養(yǎng)基營養(yǎng)物，根據(jù)細胞在不同培養(yǎng)階段的代謝狀態(tài)來供應(yīng)細胞。此外，可以修改用于喂養(yǎng)的培養(yǎng)基以促進細胞生長或刺激分子產(chǎn)生，因為不同的成分可能會改變細胞的行為，從而改變新陳代謝以達到不同的目的。進料溶液還可以設(shè)計為最大限度地減少過量代謝物的產(chǎn)生，這些代謝物會在過量時引起細胞應(yīng)激。

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